Studopediya

КАТЕГОРИИ:


Астрономия- (809) Биология- (7483) Биотехнологии- (1457) Военное дело- (14632) Высокие технологии- (1363) География- (913) Геология- (1438) Государство- (451) Демография- (1065) Дом- (47672) Журналистика и СМИ- (912) Изобретательство- (14524) Иностранные языки- (4268) Информатика- (17799) Искусство- (1338) История- (13644) Компьютеры- (11121) Косметика- (55) Кулинария- (373) Культура- (8427) Лингвистика- (374) Литература- (1642) Маркетинг- (23702) Математика- (16968) Машиностроение- (1700) Медицина- (12668) Менеджмент- (24684) Механика- (15423) Науковедение- (506) Образование- (11852) Охрана труда- (3308) Педагогика- (5571) П Arhitektura- (3434) Astronomiya- (809) Biologiya- (7483) Biotehnologii- (1457) Военно дело (14632) Висока технологиите (1363) Geografiya- (913) Geologiya- (1438) на държавата (451) Demografiya- ( 1065) Къщи- (47672) журналистика и SMI- (912) Izobretatelstvo- (14524) на външните >(4268) Informatika- (17799) Iskusstvo- (1338) История- (13644) Компютри- (11121) Kosmetika- (55) Kulinariya- (373) култура (8427) Lingvistika- (374) Literatura- (1642) маркетинг-(23,702) Matematika- (16,968) инженерно (1700) медицина-(12,668) Management- (24,684) Mehanika- (15423) Naukovedenie- (506) образование-(11,852) защита truda- (3308) Pedagogika- (5571) п Политика- (7869) Право- (5454) Приборостроение- (1369) Программирование- (2801) Производство- (97182) Промышленность- (8706) Психология- (18388) Религия- (3217) Связь- (10668) Сельское хозяйство- (299) Социология- (6455) Спорт- (42831) Строительство- (4793) Торговля- (5050) Транспорт- (2929) Туризм- (1568) Физика- (3942) Философия- (17015) Финансы- (26596) Химия- (22929) Экология- (12095) Экономика- (9961) Электроника- (8441) Электротехника- (4623) Энергетика- (12629) Юриспруденция- (1492) Ядерная техника- (1748) oligrafiya- (1312) Politika- (7869) Лево- (5454) Priborostroenie- (1369) Programmirovanie- (2801) производствено (97182) от промишлеността (8706) Psihologiya- (18,388) Religiya- (3217) с комуникацията (10668) Agriculture- (299) Sotsiologiya- (6455) спортно-(42,831) Изграждане, (4793) Torgovlya- (5050) превозът (2929) Turizm- (1568) физик (3942) Filosofiya- (17015) Finansy- (26596 ) химия (22929) Ekologiya- (12095) Ekonomika- (9961) Telephones- (8441) Elektrotehnika- (4623) Мощност инженерно (12629) Yurisprudentsiya- (1492) ядрена technics- (1748)

имунологични методи




Един примерен метод за оцветяване на клетките в теста за имунофлуоресценция

1. Лимфоцитите бяха изолирани от хепаринизирана венозна кръв чрез центрофугиране на Ficoll градиент - verografin (Urografin) (г / мл плътност 1,077) (Boyum, 1968);

2. Лимфоцитите концентрация 2 милиона до 1 мл в обем от 50 ул въвежда в центрофужни епруветки или ямки на 96-ямкова облодънна плака. Към клетките се прибавят 5 мкл тест разтвор на моноклонално антитяло и се инкубира за 30-45 минути. при + 4 ° С;

3. Прибавят се 150 мкл от разтвор на Ханкс и се центрофугира в продължение на 5 минути. при 200 г;

4. Премахване на повърхностния слой. След това се 50 л разтвор на Ханкс, клетките се суспендират се прибавя л разтвор 150 л на Hank и се центрофугира в продължение на 5 минути. при 200 г;

5. Премахване на повърхностния слой. Към остатъка се промива клетки се прибавят 50 л F (аб) 2 фрагменти от овчи анти-миши Ig маркирани с FITC разреждат 1: 100. За отглеждане физиологичен разтвор, буфериран с фосфат (PBS), съдържащ 0.5% желатин и 0,1% натриев азид (PBS може да се използва вместо разтвор на Hank). Клетките се суспендират отново и се инкубират за 30 минути при 4 ° С;

6. Клетките се промиват 2 пъти, както е описано в претенциите. 3-4;

7. Клетките са готови за наблюдение имунофлуоресценция, но ако резултатите от теста ще се счита само след няколко часа, клетките трябва да са неподвижни. Към това се прибавя 50 мкл от 1% параформалдехид в PBS (формалин може да се използва разреден 1:40 разреждане в PBS) след последното центрофугиране и отстраняване на супернатантата на клетъчната пелета. Клетките се суспендират. Фиксираните клетки запазват флуоресценция рамките на една седмица.

Оцветените клетки бяха анализирани чрез поточна цитометрия или виждат с флуоресцентен микроскоп. В последния случай, клетките се суспендират, суспензията се прехвърля в микроскопско предметно стъкло, покрита с покритие стъкло, и лекарството е разгледана чрез потапяне на флуоресцентен микроскоп (X90 леща). Най-доброто качество на изображението се постига чрез използване окуляри с леко повишение (или дори h1,7 x3). Препоръчително е да се използва не-флуоресцентен потапяне масло. Надзор трябва да се извършва в затъмнена стая. Броят на антиген-положителни клетки, определени като% fluoorestsiruyuschih клетки лимфоцити когато визуализация 200 минус% флуоресциращи клетки се наблюдават при получаването на отрицателната контрола. Като отрицателна контрола се използва препарати, получени по подобен начин, с изключение на това, че вместо на моноклоналното антитяло, клетките се третират с разтвор на Hank или нормален миши Ig.

Понастоящем всяка молекула, която притежава антигенни свойства и са налични в материала, дори в изключително ниски концентрации, може да се установи количествено, използвайки методи за имуноанализ: радиоимунологични (RIA) и ензимно имуноизследване (EIA). за имуноанализни устройства могат не само да "виждат", но също така се измери количеството на етикет предварително или свързан с антиген или антитяло. Използването като етикети материали, които при определени условия могат да се регистрират за устройства, или за човешкото око да види. Те включват:



· Радионуклидите, в този случай, анализът се нарича радиоимуноанализ (RIA);

· Ензими, които катализират превръщането на субстрата за образуване на цвят или флуоресцентен продукт. Такива анализи, посочени immunoenzyme (ELISA) или, като вид, имунофлуоресцентен;

· Флуоресцентни или луминесцентни вещества и др ..

първите методи за имуноанализ са разработени в хомогенни изпълнения, без разделяне на компонентите, т.е. в разтвор. Но скоро започва да използва анализи твърда фаза са наречени твърда фаза - разделяне на компоненти с или свързан имуносорбентен анализ (ELISA ензим-свързан имуносорбентен анализ от английски -. Ензим-свързан имуносорбентен анализ) . В момента, в практиката се използва само в твърда фаза ELISA техники опции.

метод Радиоимуно (RIA) е разработена в началото на 70-те години на миналия век. За развитието на АПИ Розалин Yalow е удостоен с Нобелова награда. Методи радиоимуноанализ особено важни за точно количествено определяне на ниски концентрации (нанограм и понякога пикограмни количества) за различните съединения, съдържащи се в течната среда, включително антитела, антигени, цитокини, разтворими форми на рецептори, протеин и стероидни хормони и други. Тези методи широко използвани в изследването на вирусни антигени, антивирусни антитела в диагностиката на автоимунни заболявания и за определяне на циркулиращи имунни комплекси.

RIA се основава на явлението на конкуренция се определя (немаркиран) антиген с известно количество маркиран антиген (антиген, белязан с изотопи 131 I, 3 H) за ограничен брой влезли в антитела система, специфични за антигена (фиг. 53). Колкото по-проба течността решена антиген, по-малко белязан антиген ще се свърже с антитялото и по този начин остават по-дълго в разтвор.

Фигура 53. Метод конкурентен радиоимуноанализ

Имуносорбентен метод анализ (ELISA) е било предложено по-малко от година, след описанието на АПИ от три независими изследователски групи: Engvall и Perlmann в Швеция, ван Weemen Schuur и в Холандия и Рубенщайн и колегите му в Съединените щати. Този метод се основава на същия принцип, като този на RIA, но вместо радиоактивен етикет се използва ензим (пероксидаза от хрян, алкална фосфатаза, глюкозидаза). Количеството на белязани антитела или антигени, нереагирал определя въз основа на промяната на цвета на субстрата под въздействието на ензима. автоматизирана ELISA читатели се използват, за да прочетете резултатите ELISA (от английски език чете. - чете).

Използвайки ELISA тестове, съдържащи поликлонални и особено моноклонални антитела могат да се идентифицират общи и специфични имуноглобулини А, М, G, Е, хормони (и двете протеинови и стероид природата), цитокини, серумни протеини (включително отделни компоненти и фрагменти допълват и ЦИК), микроорганизми (вируси, протозои и други анаероби.), хелминти и много високо молекулно тегло биологични съединения.

В момента IFA е един от най-често използваните техники иму, които са широко използвани за изследвания и диагностични цели. Например, определяне имуноанализ на цитокини е изгодно метод в сравнение с други методи за тяхното определяне, тъй като тя има висока чувствителност, специфичност, независимо от точната антагонист, и подлежат на автоматично отчитане и стандартизация.

принцип ELISA е последователното прилагане на следните етапи:

· Сорбция антиген върху твърда фаза (например, ямките на полистирол ELISA плака) за откриване на антитела към него (или адсорбирани върху твърдата фаза за откриване на антитела, специфични антиген).

· Добавяне на системата (в planshata отвор ELISA) биоанализа съдържащ специфични антитела (или антигени).

· Инкубиране на сместа в продължение на определен период от време, през който има специфично взаимодействие на антитялото и антигена върху твърдата фаза; noninteracting компоненти се отстраняват по време на пране.

· Добавяне към сместа на ензима (обикновено пероксидаза), чиито молекули конюгирани antispecies antiimmunoglobulinami (например, заек или кози антитела IgG, IgM, IgA човек) и инкубиране за определено време система.

· Добавяне към сместа на хромогенен субстрат, каталитично разлагане под действието на ензима с конюгатни antispecies антитела, и се превръща в цвят съединение.

· Може влизане оцветен продукт, който се установи визуално или спектрофотометрично: интензивност на цвета е пряко пропорционална на количеството на специфични антитела в биоанализа (Фигура 54).

Има редица варианти IFA формулиране, от които най-практическото прилагане на получената хетерогенна ELISA.

С помощта на твърда фаза, за да се опрости процеса на отделяне на реакционните компоненти поради обездвижване един от компонентите на твърдата фаза и лекотата на отстраняване на съединения, които не участват в реакцията с обикновено изпиране. Основните изисквания към твърда фаза по време на ELISA са силно възпроизводими количествени компоненти сорбционни свойства (антигени, антитела), използвани в реакцията, както и висока специфична мощност (т. Е. Способността да се адсорбира на повърхността антитела или антигени в количествата, необходими за провеждане на реакцията в комбинация с възможно най-ниско неспецифично сорбция на протеини от тестовите проби и конюгатите). Най-често срещаният метод за имобилизиране на антигени или антитела, физическа адсорбция се, при което съответните молекули са прикрепени към повърхността на твърда фаза от йонни и хидрофобни взаимодействия и водородни връзки. Широкото използване на стандартната конфигурация на плоча с 96 гнезда се оставя да се обедини оборудването, необходимо за извършване на ензимен имуноанализ.

Фигура 54. Твърдата фаза ELISA (вдясно - определяне на антитела в серума, отляво - определянето на серумен антиген)

Постановка. В Отпипетират Отпипетират се 100 мкл от разтвора на активиращия и се инкубира за 30 минути при 37 0 С Лентите време на инкубацията се поставя в пластмасова торба. След инкубирането, ямките се изпразват, ямките се промиват 3 пъти с буферен разтвор работа. Долните ямките на първите две ленти с пипета 100 ул калибриране проба, останалите ямки допринасят разреждат серумни проби се анализират чрез 100 л и се инкубират за 45 минути при 37 0 С Съдържанието на ямките се отстранява и ямките енергично разклащане непосредствено промива с работни буферен разтвор 3 пъти , Във всички ямки с пипета 100 ул конюгат разтвор, лентите запечатват и се инкубират в продължение на 30 минути при 37 0 ° С След това се разклаща на съдържанието на гнездата се отстранява, промиват се 3 пъти с работа буферен разтвор и се суши. Във всички ямки въвежда 100 л разтвор OPD се приготвя непосредствено преди употреба. Ленти покрити с капак и се съхраняват при 22 ± 4 0 ° С от силна светлина за 25-30 минути. Добавете 50 мкл Stop Solution във всички гнезда ленти. Резултатите от анализа са записани фотометрично при дължина на вълната 492 нм. Концентрациите на имуноглобулини в тестовите проби се определят чрез прилагане стойности на абсорбцията, получена в калибрационната крива.

Имуноанализ, в сравнение с други методи за откриване на антигени и антитела има важни предимства:

· Висока чувствителност (ELISA варианти съществуват че идентифициране на антитела или антигени при концентрации до няколко пг / мл);

· Възможността да се използват минимум на материала (например, да бъде достатъчно 0.5 мл серум на пациента за всички групи ELISA анализи);

· Стабилност на реагенти, използвани в тази работа;

· Възможността за автоматизация.

Всички тези предимства са идентифицирали широко използване на IFA в почти всички области на съвременната медицина.





; Дата на добавяне: 29/11/2014; ; Прегледи: 363; Нарушаването на авторски права? ;


Ние ценим Вашето мнение! Беше ли полезна публикува материал? Да | не



ТЪРСЕНЕ:


Вижте също:



zdes-stroika.ru - Studopediya (2013 - 2017) на година. Не е авторът на материала, и предоставя на студентите възможност за безплатно обучение и употреба! Най-новото допълнение , Ал IP: 66.249.93.155
Page генерирана за: 0.016 сек.